基于固定化脂肪酶稳定的O/W型Pickering乳液促进低脂奶酪中风味脂肪酸释放

背景介绍

随着健康饮食观念的深入，低脂食品越来越受到消费者的青睐。低脂奶酪富含蛋白质、钙、磷等营养成分，但由于其脂肪含量低导致游离脂肪酸（FFA）释放不足因而造成风味缺陷、影响食用口感。本研究利用部分水解的α-乳清蛋白（α-lac）肽自组装形成α-乳清蛋白（α-lac）纳米管（NTs），用于固定脂肪酶，并通过脂肪酶-纳米管稳定O/W型Pickering乳液，提高脂肪酶活性，从而促进乳脂水解增加脂肪酸释放量，进而提升奶酪风味。

研究方法

本研究使用部分水解的α-乳清蛋白（α-lac）肽自组装形成α-乳清蛋白纳米管（NTs）并用于固定脂肪酶，提高脂肪酶的催化活性，结果发现脂肪酶-NTs水解出的游离脂肪酸是游离脂肪酶水解出脂肪酸的1.5倍。通过脂肪酶-纳米管稳定乳脂形成O/W型Pickering乳液，代替奶酪制备时的原始乳脂，最终脂肪酸含量是普通低脂奶酪的两倍。该法极大的提升了脂肪酶的催化活性，促进了游离脂肪酸风味的释放。

结果与分析

1）使用透射电子显微镜（TEM）观察NTs和脂肪酶-NTs的微观形态。NTs直径为20-30 nm，长度为0.5-1.5 µm（图1A），在戊二醛的交联作用下脂肪球完全覆盖在NTs表面（图1B）。将用Cy5标记的脂肪酶（Cy5-脂肪酶）固定在NTs上（图1C），未固定的脂肪酶通过离心去除，使用荧光分光光度计检测到Cy5-脂肪酶-NTs与Cy5具有相同的吸收峰，表明Cy5-脂肪酶被成功固定到NTs上。相比于NTs，脂肪酶-NTs zeta电位由-（17.08±1.45） mV降到-（10.14±1.23） mV（图1D），这是因为在戊二醛交联过程中带正电荷氨基酸侧链的解离使得正电荷增加，净电荷量降低。

2）使用对硝基苯酯作为底物测定脂肪酶活性，绘制产物对硝基苯酚在410 nm处的吸光度-浓度标准曲线（图2）。固定化脂肪酶活性较游离脂肪酶活性显著提高（图2A），这是因为脂肪酶固定在NTs上后使其构象更有利于与底物接触，增大接触面积，提高催化效率。此外，对水解过程进行研究，绘制Lineweaver-Burk方程，发现与游离脂肪酶相比，固定化脂肪酶具有更高的Vmax，更低的Km和反应活化能（图2B）这表明脂肪酶固定在NTs上，增强了其与底物的亲和力，进而增加了催化活性。

3）酶与底物的接触面积是脂肪酶水解甘油三酯的关键因素。利用脂肪酶-NTs制备O/W型Pickering乳液，乳液中小液滴的存在改善了乳化性能，大大增加了脂肪酶和底物（油相）之间的界面面积。图3分别是37℃，pH7.0-7.5条件下，水解0，45，90 min，O/W型Pickering乳液的宏观图像（图3A）、乳液液滴微观形态（图3B）以及脂肪酶-NTs经罗丹明B染色后乳液液滴的激光共聚焦（CLSM）图像（图3C）。随着时间推移，由于Ostwald熟化，小油滴聚结成大油滴，并在90 min后显示轻微的相分离。CLSM观察发现，绿色荧光包围在液滴外层，证实了脂肪酶-NTs存在于油水界面。

4）通过酸滴定法测定相同甘油三酯含量的不同Pickering乳液（分别由脂肪酶-NTs和游离脂肪酶稳定）和非Pickering乳液产生游离脂肪酸的量，以检验由脂肪酶-NTs稳定的Pickering乳液可以加快甘油三酯水解生成脂肪酸的速率。结果发现，反应2 h后，脂肪酶-NTs稳定的Pickering乳液释放的脂肪酸是脂肪酶稳定Pickering乳液的1.5倍（图4C，图4D）。此外进一步探究了乳液液滴大小（图4A，图4B）对水解反应的影响，发现小液滴的Pickering乳液释放的游离脂肪酸（32%）高于液滴较大的Pickering乳液释放的游离脂肪酸（28%）。这是因为小液滴增大了油水界面面积进而增大了底物与酶的接触面积提高了反应速率。

5）在低脂奶酪中添加脂肪酶-NTs稳定的Pickering乳液，代替奶酪加工过程中的原始乳脂。图5是四种新鲜干酪的照片和微观结构：全脂干酪（FFC，图5A，图5E）；无酯干酪（NFC，图5B，图5F）；添加脂肪酶-NTs稳定的Pickering乳液的低脂干酪（LFC+脂肪酶-NTs，图5C，图5G）；同乳脂含量的低脂干酪（LFC，图5D，图5H）。观察到奶酪亮度随脂肪含量降低而降低，这是因为奶酪的亮度是由于脂肪球干扰光散射，脂肪含量越低，散射性越差，亮度越低，反之越高。染色后CLSM观察，酪蛋白呈绿色荧光，乳脂为红色，粉色荧光是蓝色的脂肪酶-NTs和红色的乳脂重合的颜色，这表明脂肪酶-NTs与乳脂结合。将已知脂肪、水分、蛋白质含量的FFC、NFC、LFC+脂肪酶-NTs和LFC成熟7天后使用气相色谱-质谱联用测定脂肪酸含量，发现尽管LFC+脂肪酶-NTs和LFC初始脂肪含量相同，但LFC+脂肪酶-NTs产生的游离脂肪酸总量是LFC的两倍。这是因为脂肪酶-NTs稳定的Pickering乳液提供了较大的水解反应接触面积，促进了脂肪酸的产生。

图1.NTs（图1A）和脂肪酶-NTs（图1B）的TEM图像；NTs、Cy5、Cy5-脂肪酶、Cy5-脂肪酶-NTs荧光扫描光谱（图1C）；NTs和脂肪酶-NTs zeta电位（图1D）

图2.游离脂肪酶和脂肪酶-NTs活性（图2A）；游离脂肪酶和固定脂肪酶的Lineweaver-Burk方程（图2B）

图3.乳液在不同时间水解的宏观图像（图3A）；乳液液滴微观形态（图3B）；脂肪酶-NTs经罗丹明B染色后乳液液滴CLSM图像（图3C）

图4.两种Pickering乳液液滴微观形态和液滴尺寸分布情况（图4A，图4B）；不同颗粒稳定Pickering乳液释放脂肪酸含量随时间变化（图4C）；不同颗粒稳定Pickering乳液释放脂肪酸总量（图4D）

图5.四种新鲜干酪的照片和微观结构：全脂干酪（FFC，图5A，图5E）；无酯干酪（NFC，图5B，图5F）；添加脂肪酶-NTs稳定的Pickering乳液的低脂干酪（LFC+脂肪酶-NTs，图5C，图5G）；同乳脂含量的低脂干酪（LFC，图5D，图5H）；四种新鲜干酪的化学组成（图5I）；不同新鲜干酪成熟后总游离脂肪酸含量（图5J）

结论

利用部分水解的α-乳清蛋白（α-lac）肽自组装形成了α-乳清蛋白纳米管（NTs）并用于固定脂肪酶，提高了脂肪酶的催化活性并促进了游离脂肪酸的释放进而提升了低脂奶酪的风味。本研究为固定化酶载体和低脂食品的开发提供了灵感，有效地改善了低脂食品风味缺陷的问题。

原文链接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0268005X21000679

供稿人：

李薇