超声联合pH调节法同时处理对SPI形成纳米颗粒和包覆白藜芦醇的影响
研究背景
植物蛋白因其低成本、生物相容性、生物降解性和无毒特性被广泛应用于食品和制药行业。其中大豆分离蛋白是常被用作食品级递送系统中的天然载体材料，然而未经处理的 SPI 负载白藜芦醇的能力有限。超声波可以分解蛋白质颗粒或聚集，来增强 SPI 表面疏水性。然而，直接超声处理的效率相对较低，需要较长的处理时间才能获得较好的蛋白质构象差异。pH 调节法是调节蛋白质结构的另一方法，它将初始蛋白质溶液暴露在极端碱性或酸性条件下，然后将 pH 值调回中性，使得蛋白质经历了部分展开和重折叠的过程。对于联合超声处理/pH 调节法处理对 SPI 的影响几乎没有研究。
白藜芦醇是一种多酚化合物，具有抗氧化、抗癌、神经保护和心脏保护作用。然而，白藜芦醇在水相和油相中的溶解度都非常低，当暴露于高温、紫外线或酶时会发生化学降解。这些问题限制了其在食品工业中的应用，因此可以通过将白藜芦醇负载到蛋白质复合物中来改善其应用特性。
研究内容
通过将 SPI 分散在 pH12 NaOH 溶液中，浓度为 1mg/mL，以 800 rpm 和 30°C 搅拌5分钟，并使用1M HCl调节至pH 7.0来制备 SPI 溶液，该溶液被命名为 SPI，并作为对照样品。为了避免过热效应，使用超声波处理器将对照样品进一步用 540 W 超声功率超声处理5分钟，用U7表示。将相同的超声波过程应用于冰浴中pH 12.0 NaOH 溶液中的SPI，然后使用1 M HCl 将其调节至pH 7.0，用 U12表示。对处理过的 SPI 进行表面疏水性、巯基含量和二级结构的表征，并研究三种处理对白藜芦醇包封能力的影响。
结果与分析
表面疏水性和暴露的巯基（SH）基团的含量如图1(A)所示。超声处理后 U7 的疏水性较 SPI 由 9394±237 提高到 11938±264。由于超声处理进一步暴露隐藏在蛋白质分子内的疏水残基。对于U12，超声处理结合 pH 调节法导致疏水性有效增加。蛋白质分子表面在碱性条件下呈阴性，由于静电相互作用而展开，同时超声处理可能会发挥更强的作用，从而将更多的疏水残基暴露在蛋白质表面。在碱性 pH 升高时，硫醇基团更易反应形成巯基离子(S-)，在碱性 pH 环境中，SH 氧化也会加速。此外，SH和二硫键（-S-S-）在超声应用过程中容易发生反应，两种处理方式同时进行可能会加速这种反应。因此，更多的 SH 在 U12 中反应，导致 SH 基团含量较低。如图1(B)所示，在 U12 中观察到最小的平均直径，比单独的超声处理粒径更小，这可能是因为 pH12 离蛋白质的等电点更远，因此可能导致更强的静电排斥，从而导致蛋白质聚集体减少。
图2显示了在不同浓度的白藜芦醇存在下 U7 和 U12 的荧光发射光谱以及分数残留荧光。通过测量蛋白质固有荧光的猝灭来研究加工的 SPI 和白藜芦醇之间的相互作用。白藜芦醇的添加逐渐将 λmax 移至更长的波长，这表明与白藜芦醇的相互作用使蛋白质荧光基团暴露于水环境。U7 和 U12 被不同浓度白藜芦醇猝灭的结果如图2（插图）所示，两条曲线均呈线性，R2高于0.998。对比 U7和U12的 Ka值和n值，表明 U12 对白藜芦醇具有更好的结合能力，主要是由于蛋白质的展开性增强、表面疏水性增强，从而暴露出更多的疏水基团，增强了蛋白质与小分子之间的疏水相互作用。
SPI、U7和U12对白藜芦醇的包封效率如图3(A)所示。当包封体系中加入150 μg/mL白藜芦醇时，只有约50%的白藜芦醇被包封在 SPI 中，而 U7和U12 的包封率分别为83±3%和91±4%。封装效率的增加可能导致表面疏水性的增强。SPI-白藜芦醇和U7-白藜芦醇的平均粒径相似，而U12-白藜芦醇的粒径明显小于前两者，且分布更均匀。
如图4所示，SPI、U7和U12的抗氧化活性较低，DPPH·自由基清除率均在10%左右。SPI-白藜芦醇、U7-白藜芦醇和U12-白藜芦醇的抗氧化活性分别为54.3±2.3%、56.9±0.5%和63.4±1.8%，其中U12-白藜芦醇的抗氧化活性显着高于SPI-白藜芦醇和 U7-白藜芦醇。ABTS 自由基清除活性和还原能力分析的结果与所呈现的 DPPH 自由基清除活性相似。
图1 SPI、U7和U12的表面疏水性、SH基含量（A）和粒径（B），插图：SPI、U7和U12的粒径分布
图 2 具有不同白藜芦醇浓度的 U7 (A) 和 U12 (B) 的荧光光谱。插图：使用 U7 和 U12 的最大荧光强度变化绘制log [(F0 –F)/F]与log [C (resveratrol) ] 的线性图
图 3 SPI-白藜芦醇 (C)、U7-白藜芦醇 (D) 和 U12-白藜芦醇 (E) 的封装效率、粒径 (A)、粒径分布 (B) 和形态
图4 SPI、U7 和 U12 及其与白藜芦醇的复合物分别具有抗氧化活性 (A) DPPH 自由基清除活性 (B) ABTS 自由基清除活性，(C) 还原能力
不同的小写字母代表显着差异（p<0.05）
结论
基于植物蛋白的纳米传递系统近年来受到越来越多的关注，本研究以大豆分离蛋白为材料，采用超声和pH调节法联合处理，研究了SPI的结构变化及其SPI-白藜芦醇纳米复合物形成的影响。结果表明，超声/ pH调节法联合处理的纳米颗粒粒径较小，表面疏水性较大，SPI中白藜芦醇的包封率为91.4±4.3%。因此，超声联合pH调节法同时处理的效果明显优于单独超声处理，被认为是一种有效的蛋白修饰方法，可用于白藜芦醇的高效包载和递送。
原文链接：https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0268005X20308651
供稿人：
田艳杰
