文章推荐 | 陈坚：合成生物学与未来食品

食品工业是我国的支柱产业，2022年全国食品工业的营业收入达到97 991.9亿元，年增长5.6%，利润总额占全国工业的8.1%，是我国经济发展的主要驱动力之一。食品工业的高质量发展是保障国计民生、满足人民美好生活需求的根本保障。然而，传统的食品加工生产方式面临来自生态环境、人口增长、气候变化、公共健康等多方面的挑战，人们生活水平的提高和消费结构的改变也急需对传统的食品加工生产方式进行转型升级。习近平总书记强调，要树立大食物观，构建多元化食物供给体系。在“大食物观”的理念中，未来食品主要解决食物供给和质量、食品安全和营养、饮食方式和精神享受等问题。目前，一些颠覆性的生物技术、信息技术和食品技术的交叉融合为未来食品产业的发展提供了技术保障。

食品生物制造是实现大食物观的重要途径，利用可再生原料，通过微生物细胞工厂合成食品原料或组分，是一种重要的食品绿色低碳制造模式。合成生物学技术是实现食品生物制造的核心技术，是一门融合工程学、计算科学、生物学、信息学和物理学等多个领域的综合性交叉学科。合成生物学的核心理念是基于工程化设计，改造天然的或合成新的生物体，揭示生命运行规律(建物致知)或变革生物体系工程化应用(建物致用)。利用合成生物学技术，可以设计、构建出能够高效合成特定食品原料或组分的细胞工厂，降低环境资源的利用，提高物质转化能量传递效率，保障食品的高质量供给，改良食品的营养与风味，从而推动未来食品工业的高质量可持续发展。本文总结了基于合成生物学的未来食品制造以及合成生物学在食品领域中的前沿技术及其实际应用案例，并展望合成生物学与未来食品生物制造所面临的机遇与挑战。

1  基于合成生物学的未来食品制造

近年来，合成生物学技术已被用于生产多种食品配料与组分，相对于传统的生产工艺，其特征与优势主要体现在以下三个方面：

第一，变革了传统的食品制造方式，将食品的制造模式从种植养殖模式转变为车间制作模式(图1)。目前，食品及其配料的主要生产方式仍是天然养殖和提取，占用了大量环境资源，而合成生物学技术可以利用生物质等可再生原料，在微生物细胞中合成蛋白、糖和脂肪酸等日常生活所需的食品组分和功能食品配料，摆脱了传统生产工艺对环境的依赖。通过将“定制分子”的基因线路编码进入微生物细胞工厂，能够使其“精准地”发酵目标产物，为不同人群提供定制化的食品产品，从而更好地满足消费者的个性化口味和营养需求。例如，Zhang等通过在微生物细胞中整合母乳寡糖2'-岩藻糖基乳糖(2'-fucosyl lactose，2'-FL)的生物合成途径，并重构微生物细胞中原有的代谢调控网络，获得相应的微生物细胞工厂，再经生物反应器的规模放大，实现了2'-FL的高效制备。

图1  基于合成生物学的未来食品制造

第二，助力了食品的低碳制造。传统的食品生产方式排放了全球约25%的温室气体。我国力争在2030年前实现碳达峰，2060年前实现碳中和，在这个过程中不仅要减排，还要固碳。随着合成生物学技术的发展，生物制造可以将生物质、C1原料等可再生资源转化为蛋白、淀粉、脂肪酸等食品，既能减排，又能固碳。相对于传统的养殖法生产乳蛋白，发酵法生产乳蛋白能够每年减少56%的CO2排放和87%的土地占用面积。Cai等利用电催化将CO2转化为甲醇，在酶的催化下，甲醇在生物反应器中经过11步反应转变为淀粉，实现了基于碳捕集的淀粉人工合成。相对于从玉米中提取淀粉，人工合成淀粉的生产周期从150 d降低至3 d，碳转化速率提高了8.5倍。

第三，强化了食品的生产过程。据联合国统计，世界人口将在2050年增长至96亿，从而导致全球食品的需求量将增加50%~80%。此外，随着生活质量的显著提升，消费者对优质蛋白、肉等食品的需求逐步增加。生产替代蛋白是解决肉类资源紧缺的有效途径之一。典型的案例是人造肉的生物制造，采用大豆、玉米、芝麻、燕麦等植物蛋白作为原料，经过低湿或高湿减压合成植物蛋白肉。通过从动物组织中提取分离种子干细胞，在大规模的生物反应器中进行增殖、分化成为肌肉纤维或组织，再经过食品加工，可以快速获得风味和口感与真实动物肉类似的细胞培养肉。相比畜牧养殖，细胞生产蛋白质的碳水化合物转化率可以达到50%~60%，畜牧法生产猪肉和牛肉的能量与蛋白转化率仅为9%和3%。

2  合成生物学在食品领域的前沿技术

基于合成生物学的生物制造已经涵盖了食品、医学、燃料、农业等多个领域，其核心在于构建能够高效合成目标产物的细胞工厂。整个流程包括高性能底盘细胞的构建、食品配料或组分合成途径的挖掘与设计、途径酶的高效组装、细胞代谢调控网络的重构与优化和高产菌株的高通量筛选(图2)。

图2  基于合成生物学的细胞工厂构建流程

目前，常用于合成食品配料或组分的底盘细胞包括大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)等。每种宿主都有自己独特的生理和遗传特征，通常需要根据目标产物的类型来选择合适的宿主。例如，E. coli 和B. subtilis 适合合成中心代谢的衍生物，S. cerevisiae 更适合合成萜类化合物，P. pastoris 适合高效表达蛋白，C. glutamicum 适合生产氨基酸等。然而，天然的宿主细胞可能存在冗余基因较多、前体供应不足、产物耐受性差等问题，降低了目标产物的合成效率。一些研究通过删除宿主中的冗余基因、加强前体代谢途径、辅因子工程和适应性进化等策略，获得了基因组精简、前体充足、产物耐受性高的底盘细胞。

在底盘细胞中整合食品配料特定的生物合成途径，才能使底盘细胞精准的合成目标产物。其中涉及如何挖掘和鉴定目标产物的合成途径，如何高效地将途径酶的相关基因快速组装并整合进入底盘细胞。随着计算科学和组学技术的发展，国际上已经建立了多个储存基因、蛋白和代谢途径信息的数据库，如KEGG、Biocyc、Uniprot、PDB等，并且开发了多种计算软件用于预测特定化合物的合成途径，如Pathway Tools和iPath等。此外，基因合成技术的发展使合成基因的价格从2010年的2.6元/bp降至如今的0.6元/bp，Gibson Assembly和Golden Gate等多种方法的开发为DNA高效组装提供了技术保障。CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)等基因组编辑工具的快速发展实现了异源基因和DNA大片段的高效整合。

异源整合的途径通常与底盘细胞的适配性较差，限制了目标产物的合成效率。这是由于细胞固有的代谢网络总是倾向于将碳氮源转化为自身生长所需的化合物，从而弱化了异源途径的代谢流。因此，如何重构底盘细胞的代谢调控网络，增加产物合成途径的代谢通量，是提升产物合成效率需要解决的关键问题之一。目前，国际上已经开发了多种代谢调控元件用于代谢网络关键基因表达量的精细控制，如启动子文库、RBS(ribosome binding site)、蛋白质降解标签、核酸适配体和5'-UTR(untranslated region)等。同时，国际上也建立了一些调控系统用于协同调控各个代谢模块间的代谢通量，如CRISPRi系统(CRISPR interference)、CRISPRa系统(CRISPR activation)和基因线路等。导致异源途径和底盘细胞适配性差的另一个原因是途径酶在底盘细胞中的催化活性通常较低。因此，需要挖掘和筛选具有更高催化活性的同工酶或者对现有酶进行设计和改造。传统的酶活测定方法需进行酶动力学实验，成本较高且效率较低。目前，一些基于机器学习的计算方法已经可以预测蛋白的三维结构和酶的催化活性。

传统的细胞工厂生产性能检测方法主要包括生化检测、液相检测和质谱检测等，这些方法的检测效率最高仅能达到10³/d。然而，随着自动化系统的快速发展，底盘细胞的构建效率能够达到10⁹/d，显著高于传统检测方法的细胞筛选效率，意味着需要寻找更高效的产量检测方法。生物传感器的设计、构建与应用是合成生物学的研究热点之一，它能够将目标产物的浓度转化为荧光信号的强弱，结合流式细胞术或者微流控系统，菌株的筛选通量可以达到10⁹/d，显著提升高产菌株的筛选效率。

3  合成生物学合成食品配料和组分的代表案例

乳蛋白是动物奶的主要成分之一，具有促进生长发育、免疫调节、维持婴幼儿大脑中血清素水平、抗氧化等生理活性。母乳中的乳蛋白主要由酪蛋白(占40%)和乳清蛋白(占60%)组成，其中，乳清蛋白包括α-乳白蛋白、乳铁蛋白、骨桥蛋白等。传统的乳蛋白制备方法主要是从牛奶中提取，以乳铁蛋白为例，每14 kg牛奶可以提炼1 g乳铁蛋白，提取成本高、工艺复杂、技术难度大。随着基因工程和发酵工程技术的发展，国际上已开发了乳蛋白的发酵合成工艺(图3)。例如，美国Perfect Day公司开发了6种乳蛋白的酵母表达工艺，并通过乳蛋白复配、添加脂肪酸和多种风味物质，建立了一条人造奶的绿色制造路线。然而，发酵法合成乳蛋白仍存在表达量低、糖基化修饰难以控制等问题。

图3  乳蛋白的发酵合成工艺

基于合成生物学技术，多种底盘细胞被创制用于乳蛋白的异源表达，同时一系列蛋白表达调控工具和策略被开发用于乳蛋白的高效表达。黄建东等测试了7种乳蛋白分别在E. coli、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)中的表达情况。基于代谢网络模型对K. lactis 中蛋白表达的相关基因进行调控，最终使牛血清白蛋白和β-乳球蛋白的表达量超过细胞总蛋白量的50%。Wu等基于T7表达系统在B. subtilis 中构建了T7-BOOST系统用于促进基因的转录，实现了αS1酪蛋白和乳铁蛋白在B. subtilis 中的异源表达。Deng等通过筛选启动子、分泌信号肽和共表达蛋白二硫键异构酶A3(hPDIA3)，使α-乳白蛋白在P. pastoris 中的产量达到6 mg/L。经3-L发酵罐发酵条件优化，α-乳白蛋白的产量达到56.3 mg/L。Lv等通过筛选分子伴侣、促溶标签以及构建杂合信号肽，获得可高效合成乳铁蛋白的P. pastoris。在3-L发酵罐中对甲醇诱导条件进行优化调控，乳铁蛋白的表达量可以达到5.38 g/L。为降低原料成本，Lv等建立了化学-生物级联催化(chemical-biological cascade catalysis，CBCC)系统，能够直接以CO₂为底物合成乳蛋白，乳铁蛋白的产量及碳原子转化率分别为56.2 mg/L与0.17%。

人乳寡糖(human milk oligosaccharides，HMOs)是人乳中含量仅次于乳糖和脂肪的碳水化合物(初乳含量为20~25 g/L，成熟乳含量为10~15 g/L)。HMOs具有益生元、免疫调节和拮抗病原体的功能，对新生儿的生长发育具有重要作用。目前，人乳中已经发现了200多种不同的HMOs，含量较多的几种HMOs分别是：2'-岩藻糖基乳糖(2'-FL)、3-岩藻糖基乳糖(3-fucosyllactose，3-FL)、乳糖-N-新四糖(lacto-N-neotetraose，LNnT)、乳糖-N-四糖(lacto-N-tetraose，LNT)、6'-唾液酸乳糖(6'-sialyllactose，6'-SL)和3'-唾液酸乳糖(3'-sialyllactose，3'-SL)等。随着国际母乳喂养率的降低和功能营养品概念的日益普及，HMOs作为食品添加剂的市场规模不断扩大。2022年全球HMOs市场规模为129.9亿美元，预计从2023年到2030年将以17.6%的复合年增长率增长。

目前，已有超过15种不同的HMOs可以化学合成，但化学合成HMOs需要多步基团保护操作，且这些步骤会随着糖链的增长而增加。同时，较低的原子经济性增加了试剂成本，过多的提纯步骤降低了产物的收率。因此，大多数HMOs的化学合成都不具有经济效益。微生物发酵由于能够利用廉价生物质作为原料，且生物合成步骤具有高度的特异性，已成为工业生产HMOs的理想方式。近年来，美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)、欧盟委员会、澳大利亚新西兰食品标准局等已批准数种HMOs(2'-FL、LNnT等)用于婴幼儿配方食品等食品类别。2016年以来，我国国家食品安全风险评估中心就合成法和发酵法生产2'-FL、LNnT作为新品种食品添加剂多次公开征求意见。至2023年10月7日，国家卫生健康委员会发布了《关于桃胶等15种“三新食品”的公告》，正式明确了发酵法生产的2'-FL及LNnT可在我国合法使用。

合成生物学及其工具的快速发展显著提高了微生物细胞工厂发酵合成HMOs的性能。目前，已有42种HMOs实现了微生物合成。E. coli 是最为常见的HMOs生产菌株，2'-FL、3-FL、LNnT、LNT、3'-SL、6'-SL等多种HMOs都已实现了在E. coli 中的合成。此外，B. subtilis、S. cerevisiae、C. glutamicum 等GRAS(generally recognized as safe)菌株由于生长迅速、遗传操作简单、易于扩大培养等特点，也已成为合成HMOs的理想宿主。

2'-FL是研究最为广泛的HMOs。通过在微生物宿主中整合2'-FL的从头合成途径或回补合成途径均可实现2'-FL的生物合成。为降低发酵成本，研究人员利用合成生物学技术逐步实现了发酵碳源从“昂贵”到“廉价”、“多个”到“单一”的转变(图4)。Deng等在B. subtilis 中构建了2'-FL的回补合成途径，实现了B. subtilis 利用L-岩藻糖和乳糖为底物合成2'-FL。Zhang等利用模块化工程组合异源合成途径，搭建出2'-FL的从头合成途径，实现了B. subtilis以利用廉价碳源蔗糖和乳糖为底物合成2'-FL。Parschat等通过鉴定和筛选高效的β-(1，4)-半乳糖基转移酶，并将其整合进入E. coli 基因组，获得了仅使用蔗糖作为底物合成2'-FL的重组菌株。此外，研究人员还开发了多种合成生物学元件和系统用于调控2'-FL的代谢网络，从而提高2'-FL的产量。例如，基于CRISPRi的多通路微调系统、基于热传感器的温敏调控系统、基于相分离的无膜细胞器、基于自组装肽的多酶复合物系统等。此外，α-1，2-岩藻糖基转移酶是2'-FL合成途径中的限速酶，为提高其催化效率，研究人员筛选和测试了不同来源α-1，2-岩藻糖基转移酶的催化活性，结果显示E. coli O126来源的α-1，2-岩藻糖基转移酶(WbgL)具有较高的催化活性。为了实现HMOs高产菌株的高通量筛选，Enam等构建了一个基于糖苷酶的全细胞生物传感器，该传感器可将HMOs的浓度信号转化为荧光强度信号，从而提高了高产菌株的筛选效率。

图4  2'-FL的合成途径及常用改造策略

7-脱氢胆固醇(7-Dehydrocholesterol，7-DHC)是维生素D3的前体，皮肤中的7-DHC经紫外线照射可生成维生素D3(vitamin D3，VD3)。VD3在人体中具有调节钙磷代谢、促进肠道钙磷吸收、骨质钙化和治疗佝偻病等功能。人体内VD3的含量随着年龄的增长而下降，因此，随着全球老龄化现象的日益凸显，VD3的重要性和需求逐年增加。7-DHC的制备是VD3合成的难点，目前传统的制备方法主要采用溴化/脱溴/化氢法和氧化/还原/消除法。溴化/脱溴/化氢法的主要问题是含溴副产物难以完全去除，对环境有害，并会影响后续7-DHC转化为VD3。氧化/还原/消除法的主要问题是氧化剂(三氧化锆等)会严重污染环境，且还原反应要求高温，耗能高。此外，化学法合成的原料需要从羊毛脂中提取胆固醇，此过程中产生的废弃物只能焚烧处理。相比于化学合成法，微生物合成7-DHC因环境友好、反应条件温和、原料便宜易获得等优点备受关注。

S. cerevisiae 自身并不存在7-DHC的合成路径，无法天然生产7-DHC，但S. cerevisiae 天然存在酵母甾醇的合成途径，可为7-DHC的合成提供前体。因此，S. cerevisiae 是合成7-DHC的理想宿主之一(图5)。2006年，Lang等首次通过在S. cerevisiae 中整合7-DHC合成途径的必需基因，实现了7-DHC在S. cerevisiae 中的从头合成。随后，研究人员开发了多种代谢工程和合成生物学工具和策略来提高7-DHC的合成效率。张莹等通过过表达tHMGR和ERG1，增强甲羟戊酸合成路径通量，敲除ERG5和ERG6阻断麦角固醇合成路径，引入人源DHCR24，使7-DHC的产量提升至5.5 mg/g DCW。Guo等采用区室化工程策略，将7-DHC合成路径中的ERG2、ERG3、DHCR24、ERG25、ERG26、ERG27靶向脂滴，ERG1、ERG11、ERG24靶向内质网，使摇瓶中7-DHC的产量达到360.6 mg/L。为预测7-DHC合成途径中潜在的限速步骤，Qu等利用基因组规模代谢网络模型预测了7-DHC代谢网络中的关键调控节点，并进一步利用CRISPRi系统调控关键节点相关基因的表达水平，最终使7-DHC在3-L发酵罐中的产量达到1 328 mg/L。Xiu等采用系统合成生物学策略，通过过表达6个关键基因来提高前体供应，构建并应用CRISPR激活和抑制系统使代谢通量更多地流向7-DHC合成途径，将甾醇合成路径定位于内质网，最终使7-DHC在摇瓶中的产量达到455.6 mg/L，在 5 L罐中的产量达到2 870 mg/L。

图5  7-DHC的合成途径及常用改造策略

随着居民生活水平的不断提高，消费者对肉制品的需求也逐步增大。2022年我国肉类产量达到9 328.44万吨，年增长3.7%。然而，传统的畜牧养殖占用大量水土资源且存在食品安全风险隐患，且畜牧业是食品生产系统中最大的温室气体排放行业，占全球排放总量的15%，与交通运输系统的排放量大体相同。波士顿咨询公司预测，若替代蛋白可占据22%的肉类市场份额，2030年将实现减排2.2万吨二氧化碳当量。因此，开发绿色、安全、健康、美味的人造肉生产工艺成为了国际研究热点之一。目前，一些植物肉和动物肉产品已经被批准进行销售。例如，Beyond Meat开发的一种植物肉汉堡已经进入国内市场；Upside Foods与GOOD Meat研发的细胞培养鸡肉先后获得FDA的无异议函，并获得美国农业部(United States Department of Agriculture，USDA)的“Grant of Inspection”(GOI)检查授权，已经被允许在美国进行销售。

然而，人造肉在风味、口感、品质等方面仍与真实肉存在较大差异。合成生物学的发展为人造肉外观、风味、口感、品质等特性的提升提供了新方法。血红蛋白和肌红蛋白是动物源肉类的关键风味催化剂和着色剂，因此，在人造肉中添加血红蛋白和肌红蛋白可以增加其颜色和风味特征。已经有多种不同来源的血红蛋白和肌红蛋白实现了在微生物中的生物合成。然而，血红蛋白和肌红蛋白的生产受到球蛋白表达水平较低以及血红素供应不足的限制。Xue等通过优化蛋白表达方式、增加5-氨基乙酰丙酸的合成、解除血红素合成的限速步骤等，首次实现了牛和猪血红蛋白在S. cerevisiae 中的微生物合成，并且大豆和三叶草血红蛋白的产量分别达到108.2和13.7 mg/L，牛和猪肌红蛋白的产量分别达到68.9和85.9 mg/L。Shao等通过增加基因拷贝数、改造血红素合成分解途径和加强血红蛋白分泌，使大豆血红蛋白在P. pastoris中的产量达到3.5 g/L。

植物肉缺乏真实肉中的纤维结构，肉质疏松是导致其口感和品质较差的主要原因。在植物肉加工过程中添加交联酶可以促进其形成类似于真实肉的纤维结构，提高口感与品质。谷氨酰胺转氨酶是最为常用的交联酶，能够将谷氨酰胺残基上的氨基转移给邻近的赖氨酸残基，生成稳定的共价键，从而形成交联结构，促进蛋白质结构稳定。茂源链霉菌(Streptomyces mobaraensis)是谷氨酰胺转氨酶的商业化生产菌株。Yin等通过菌株随机诱变和增加谷氨酰胺转氨酶的拷贝数，使谷氨酰胺转氨酶的产量提高了13倍，达到40 U/mL。Wang等利用丙氨酸扫描、组合定点饱和突变和优化蛋白表面净电荷，使谷氨酰胺转氨酶的热稳定性和催化活性分别提高了10倍和2.5倍。

细胞工厂生产的多种其他产物也可用于提高人造肉的品质。例如，植物肉存在醇、醛等挥发性物质，导致其具有一定的豆腥味。使用醇、醛脱氢酶将醇、醛等挥发性物质分解，可以显著提高植物肉的风味。一些特定的人群对植物蛋白肉过敏，筛选、表达特异性的蛋白酶能够将植物肉中特定的过敏原降解，使其分解成为氨基酸和短肽，在去除过敏原的同时保留其营养成分。此外，人造肉的风味与口感与其含有的脂肪酸含量与种类有关。Gajewski等对S. cerevisiae 的脂肪酸合成酶进行改造，通过改变脂肪酸合成酶的底物特异性，实现了中链脂肪酸(己酸和辛酸)的高效合成。Zhu等通过酶、代谢途径和细胞三个层次对S. cerevisiae 进行多维工程改造，使中链脂肪酸的产量提升了250倍，达到1 g/L。Wang等采用“推-拉-阻”策略，通过重构脂肪酸和甘油三酯的合成与降解途径，提高了解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中油酸的含量，达到56 g/L，占总脂肪酸的84%。

4  挑战与展望

合成生物学技术为未来食品绿色、可持续、高效的制造提供了技术支持。然而，我国的合成生物学发展仍存在技术研发能力不足、重大共性关键核心技术突破不多、基础研究对产业贡献少、核心工业菌种知识产权风险高等问题。例如，菌种的遗传信息大多储存于国外公共数据库，存在断更风险。我国使用的基因编辑工具大多是在国外已报道的编辑系统上进行优化，具有完全自主知识产权的基因编辑工具较少，高性能酶的设计软件都是由国外开发，且蛋白质的从头设计技术严重落后于国外。令人鼓舞的是，近年来我国在基础研究领域已取得一些显著进展，如2022年我国搭建了第一个生物信息数据库BioXFinder；中国科学院神经科学研究所杨辉团队开发了首个具有完全自主知识产权的基因编辑系统CRISPR/Cas13X；中国科学技术大学刘海燕、陈泉团队开发了一种蛋白质骨架结构的设计新方法。

虽然我国是食品原料制造大国，但离强国仍有一定差距，主要体现在生产效率较低、环境污染较为严重、高端产品较少等方面。造成此种现象的关键原因在于多数核心工业菌株和高端食品原料生产制备技术被国外长期垄断。例如，细胞培养肉所需的高端培养基几乎完全依赖于进口，而制约我国高端细胞培养基产业化的核心因素为缺乏核心原料氨基酸的高效合成菌株，如组氨酸、精氨酸等；缺乏高纯度氨基酸的纯化技术，氨基酸产品品质不达标。基于合成生物学的未来食品生产工艺与传统的食品制造工艺存在显著差异，急需建立新的质量检测指标和质量控制标准。目前，国外已经审批通过了多种基于合成生物学的未来食品，而我国的进度则相对缓慢，存在国内市场被抢占的风险。因此，我国应加快对未来食品生产工艺中的高风险流程的评估工作，企业应联合高校和科研院所加快制定团体标准、行业指南，为我国制定相应的质量检测标准提供更多的科学依据。