无搅拌Pickering乳液进行高效酶催化

背景介绍

脂肪酶是一种高特异性和高效性的水溶性生物催化剂，在食品加工中广泛用于开发天然香料、营养物质和结构脂质等。脂肪酶的底物大多为油相，催化过程是在两相系统中进行的，两相系统反应界面面积有限、传质阻力大，因此催化效率较低。使用表面活性剂稳定乳液进行酶催化可以增大酶促反应的界面面积，但是该法不利于产品纯化和酶的回收。并且在该反应体系中，需要进行搅拌和振荡，这会破坏酶的三维结构。固定化酶可以避免以上问题，但是固定化过程也会改变酶的三维结构从而减低酶的活性。由固体颗粒稳定的Pickering乳液为解决以上酶催化过程中遇到的问题提供了理想的方法。

研究方法

本研究制备W/O型Pickering乳液催化体系替代传统的两相酶促反应体系，并且比较了南极假丝酵母脂肪酶B（CALB）在两种体系中的反应动力学。最后通过离心对CALB进行回收，发现在循环使用27次后，CALB在Pickering乳液催化体系中催化效率明显高于常规两相系统的催化效率。

结果与分析

1）使用甲基改性SiO₂纳米颗粒稳定W/O型Pickering乳液（图1A）用作酶促反应介质，水相以微米级小水滴的形式分散在油相中，分别用光学显微镜和激光共聚焦显微镜观察罗丹明B染色后的CALB。由于酶是水溶性的，因此被分隔在大量水滴中（图1B，a、b）。足够大的油水界面使得酶促反应在无搅拌条件下高效地进行。

2）反应完后将体系离心破乳使用紫外-可见分管光光度计测定水溶液中CALB的浓度，计算固体颗粒上酶的吸附率为53.3%。使用外消旋酯乙酸1-苯乙酯的水解动力学（酯对映体过量，ee_s值；醇对映体过量，ee_p值）来检验体系的催化性能（图2A）。结果表明无搅拌的Pickering乳液催化体系反应速率远高于常规两相催化体系，与搅拌速度为1350rpm/min的常规两相体系相当。360min后，无搅拌的Pickering乳液催化体系中酯和醇的ee值均高达96%，显著高于未催化之前的ee值（2%）。根据反应最初60min的ee值估算CALB在不同反应体系的比活度（图2B）。在常规无搅拌双相体系中，CALB的比活度仅为0.2U/mg，随着搅拌速率的增加，使得底物和酶接触显著，酶活提升。搅拌不会明显提高Pickering乳液催化体系中CALB比活性，这是因为Pickering乳液本身不需搅拌即具有较大的油水界面面积和较短的分子扩散距离。

3）通过在无搅拌Pickering乳液催化体系中添加不同量（0.25%、0.5%、1.0%、2.0%和3.0%）的固体颗粒证明CALB在不同液滴大小乳液体系中的催化活性。光学显微镜检测结果显示，随着固体颗粒浓度的增加，乳液液滴逐渐减小（图3A）。随着乳液液滴的减小，反应速率加快（图3B）、CALB的比活性增加（图3C）。这是因为固体颗粒用量增加不仅会使总的油水界面面积增加，而且由于液滴填充效应，无数小液滴紧密堆积形成三维网络反应体系，在网络体系中酶吸附在油水界面或被分隔在水滴中，反应底物却被限制在水滴之间的空隙中。因此乳液液滴越小，酶和底物之间的扩散距离越短，酶的比活性越高。而当固体颗粒的量由2.0%增加到3.0%时，比活性增加不明显。这是因为固体颗粒浓度达到一定浓度时，其覆盖在油水界面上又会阻碍底物和酶的接触，因此在高浓度的固体颗粒稳定的乳液中酶的比活性没有明显的增加。

4）进一步探究无搅拌Pickering乳液催化体系的可回收性。第一次催化反应后ee_s值为96%，ee_p值为99%，对第一次反应后的体系离心，体系迅速破乳，相分离。上层为有机产物，将保留在下层水相中的固体颗粒和酶分离出来用于下一个反应周期，得到第二次反应周期的ee_s值为高达95.4%，ee_p值99%。直到第27个反应周期，乳液液滴仍能保持良好的形态（图4A，A1；A2），反应的ee_s值仍为高达87.5%，ee_p值99%（图4A，A3；A4）。相比之下，常规两相反应从第三个反应周期ee_s值开始下降，虽然ee_p值没有降低（图4B，B2）；到第九个反应周期ee_s值仅为73.6%（图4B，B1）。这是因为无搅拌Pickering乳液催化体系避免了酶三维结构损坏导致的酶活降低。

图1 甲基改性SiO₂纳米颗粒稳定制备W/O型Pickering乳液（图1A）；罗丹明B标记CALB的光学显微镜图像和（图1B，a）激光共聚焦显微镜图像（图1B，b）

图2 外消旋酯乙酸1-苯乙酯的水解动力学（图2A）；无搅拌双相催化体系（图2B，a）、900rpm/min搅拌双相催化体系（图2B，b）、1350rpm/min搅拌双相催化体系（图2B，c）、无搅拌Pickering乳液催化体系（图2B，d）、900rpm/min搅拌Pickering乳液催化体系（图2B，e）/1350rpm/min搅拌Pickering乳液催化体系（图2B，f）

图3 不同浓度固体颗粒稳定的Pickering乳液光学显微镜照片（图3A）；不同浓度固体颗粒稳定的Pickering乳液催化反应动力学图（图3B）；液滴大小和CALB比活性随固体颗粒用量变化（图3C）

图4 第一次循环Pickering乳液光学显微照片（图4A，A1）、27次循环后Pickering乳液光学显微照片（图4A，A2）、在无搅拌Pickering乳液催化体系中ee_s值随反应周期变化（图4A，A3）、在无搅拌Pickering乳液催化体系中ee_p值随反应周期变化（图4A，A4）、常规两相催化体系中ee_s值随反应周期变化（图4B，B1）、常规两相催化体系中ee_p值随反应周期变化（图4B，B2）

结论

证明了Pickering乳液催化体系在无需搅拌的条件下无需固定酶仍能进行高效的酶促反应。相比于常规两相催化体系，Pickering乳液催化体系是在静态条件下增大了油水界面面积，缩短了酶与底物的扩散距离，提高了催化效率，并且可用于多次循环回收和利用。

原文链接：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssuschemeng.6b01776

供稿人：

李薇